大多數(shù)用于分離肝細胞的傳統(tǒng)方法使用粗制和部分純化的酶制劑，包括各種類型的膠原酶和其他蛋白酶。最近，使用更好表征的膠原酶制劑，例如 Worthington Types 1 和 4 (CLS-1, 4)，已經(jīng)提供了更好的結(jié)果。所有粗膠原酶制劑都可能包含批次不同的污染蛋白酶、酯酶和其他酶，需要研究人員預(yù)先篩選幾批酶和/或不斷修改分離參數(shù)和協(xié)議。

Worthington 肝細胞分離系統(tǒng)的開發(fā)旨在為研究人員提供可靠、方便且一致的肝細胞分離系統(tǒng)。通過使用該試劑盒中包含的預(yù)先優(yōu)化的酶組合，可以最大限度地減少批次間的差異并提高分離肝細胞的質(zhì)量。此外，Worthington 通過從成年大鼠中分離肝細胞來對每一批次進行使用測試，以確?；罴毎男阅?、可靠性和一致的產(chǎn)量。

該方法基于 Berry, MN 描述的方法，由 Seglen, PO 修改（細胞生物學(xué)方法，第 XIII 卷，David M. Prescott 編輯，學(xué)術(shù)出版社，1976 年；第 4 章，“分離大鼠肝細胞的制備"， pp 29-83），并與幾位研究人員一起進一步優(yōu)化。

穩(wěn)定性/儲存：試劑在環(huán)境溫度下可在正常運輸程序中預(yù)期的時間內(nèi)保持穩(wěn)定，但包裝應(yīng)在抵達時冷藏。內(nèi)容物在使用前可在 2-8°C 下儲存 4-6 個月。儲存在 2-8°C。

包裝內(nèi)容 包裝中包含足夠的材料，可用于五個單獨的成年大鼠肝臟灌注。對于較大或較小的組織應(yīng)用，請在每個步驟中制備成比例的試劑，并按照協(xié)議中所述的相同比例將它們組合起來。

小瓶 #1：10X CMF-HBSS 濃縮液，1 瓶，500 毫升無菌不含鈣和鎂的漢克平衡鹽溶液 (CMF-HBSS)。在加入解離酶溶液之前，該溶液用于洗滌和灌注肝臟。

小瓶 #2：22,500 單位膠原酶和 30 單位彈性蛋白酶，5 小瓶 Worthington 膠原酶（代碼：CLS-1）和彈性蛋白酶（代碼：ESL），通過 0.22µm 孔徑膜過濾并凍干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液重新配制，并按照以下程序的指示輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解內(nèi)容物。將未復(fù)溶的小瓶儲存在 2–8°C。

小瓶 #3：每瓶 1,000 單位 DNase I，5 小瓶 Worthington DNase I（代碼：D），通過 0.22µm 孔徑膜過濾并凍干。使用前，用 L-15/MOPS 溶液重新配制，并按照以下程序的指示輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解內(nèi)容物。將未復(fù)溶的小瓶儲存在 2–8°C。

小瓶 #4：0.15M MOPS，pH 7.5，1 瓶，75ml 0.15M MOPS，pH 7.5 緩沖液濃縮物，用于緩沖重組的 Leibovitz L-15 培養(yǎng)基。小瓶 #5：7.5% 碳酸氫鈉 (NaHCO3)，1 瓶，100ml 7.5% 碳酸氫鈉濃縮液，用于緩沖稀釋的 CMF-HBSS。

小袋，裝有 Leibovitz L-15 培養(yǎng)基粉末，1 x 1 升 通過切開信封頂部并將內(nèi)容物倒入裝有大約 800 毫升細胞培養(yǎng)級水的燒杯中，重構(gòu)小袋中的全部內(nèi)容物。再用 100 毫升水沖洗小袋 2 - 3 次。使總體積達到 1000 毫升并通過 0.22 微米孔徑的膜過濾。

參考

Alpini 等，“肝細胞分離的最新進展"，Hepatology (1994) 20:494-514。

貝里，明尼蘇達州，愛德華茲，上午和巴里特，GJ；分離的肝細胞：制備、特性和應(yīng)用，RH Burdon 和 PH Van Knippenberg，編輯，愛思唯爾，阿姆斯特丹，紐約，牛津，第 1 章。2, 1991.

Chen HL、Wu Hl、Fon CC、Chen PJ、Lai、MY、Chen DS (1998) 成人肝細胞的長期培養(yǎng)。生物醫(yī)學(xué)科學(xué) 5:435-440

DeRobertis, EDP, Saez, FA 和 DeRobertis, EMF: Cell Biology, 6th ed., WB Saunders Co., Philadelphia, PA, 1975。

Freshney, R. Ian：動物細胞培養(yǎng)，Alan R. Liss, Inc.，紐約，2000 年。

漢克斯、JH 和*，RE：Proc。社會。經(jīng)驗。生物。醫(yī)學(xué)，71, 196 1949。

Jakoby, WB 和 Pastan, IH：酶學(xué)方法卷。第 18 頁 121，學(xué)術(shù)出版社，1979 年。

Le Cluyse EL (2001) 用于體外評估細胞色素 P450 酶表達和調(diào)節(jié)的人類肝細胞系統(tǒng)。歐元。J Pharm Sci 13：343-368。

Le Cluyse EL, PL Bullock, A Parkinson (1996) 在大鼠肝細胞長期培養(yǎng)中恢復(fù)和維持正常肝臟結(jié)構(gòu)和功能的策略。高級 Drug Del Rev 22：133-186。

Leibovitz, A.：與大氣自由氣體交換的組織/細胞培養(yǎng)物的生長和維持，Am。J. Hyg., 78, 173, 1963。

Seglen，PO，細胞生物學(xué)方法，卷。XIII，David M. Prescott 編輯，Ch。4，第 29-83 頁，學(xué)術(shù)出版社，1976 年。

沃辛頓酶手冊，沃辛頓生化公司，新澤西州弗里霍爾德，1993 年。

沃辛頓組織解離指南，沃辛頓生化公司，新澤西州萊克伍德，2003 年。 

相關(guān)產(chǎn)品：

膠原酶 (CLS1-4/CLSPA)
脫氧核糖核酸酶I (DP/D/DCLS/D2/DPFF/DPRF)
彈性蛋白酶 (ES/ESL)
透明質(zhì)酸
酶 ( HSE/HSEP)中性蛋白酶 (Dispase, NPRO)
木瓜蛋白酶 (PAP/PAPL/PAP2)
蛋白酶 K (PROK)
胰蛋白酶 (TL/TRL/TRL3/TRLS/TRTPCK)
胰蛋白酶抑制劑 (LBI/OI/SI/SIC)

細胞分離優(yōu)化系統(tǒng) (CIT)
新生兒心肌細胞分離系統(tǒng) (NCIS)
木瓜蛋白酶解離系統(tǒng) (PDS/PDS2)