qiagen REPLI-g線粒體DNA試劑盒說(shuō)明書

REPLI-g Mitochondrial DNA Kit

REPLI-g線粒體DNA試劑盒

從人類和非人類線粒體DNA高度均勻地?cái)U(kuò)增全基因組

• 不同樣品類型的靈敏擴(kuò)增
• 適用于擴(kuò)增人類和非人類mtDNA
• 克服了耗時(shí)的mtDNA分離的需求
• 核DNA降解的樣品提供的信息性結(jié)果
• 血卡和頭發(fā)的DNA擴(kuò)增

REPLI-g線粒體DNA試劑盒可從總DNA樣品中選擇性擴(kuò)增線粒體DNA，而無(wú)需事先分離線粒體DNA。該試劑盒提供了DNA聚合酶，緩沖液和試劑，用于從總DNA樣品中的人類和非人類線粒體DNA小樣品中特異性和均勻地?cái)U(kuò)增整個(gè)基因組。為了擴(kuò)增非人類mtDNA，需要用適合該物種的合適引物混合物替換REPLI-g人類mt引物混合物（試劑盒未提供）。REPLI-g線粒體DNA試劑盒基于多置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA），可富集線粒體DNA，而核DNA污染小，從而避免了耗時(shí)的線粒體DNA分離，并提高了下游測(cè)定的靈敏度。

REPLI-g線粒體DNA試劑盒適用于分子生物學(xué)應(yīng)用。本產(chǎn)品不用于診斷，預(yù)防或治療疾病。

產(chǎn)品詳情

性能

總DNA制劑通常包含約0.1％的線粒體DNA（例如，0.1 ng的總?cè)祟怐NA包含0.1 pg的線粒體DNA）。REPLI-g線粒體DNA試劑盒提供了整個(gè)人類線粒體基因組的特異性擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生約4 µg擴(kuò)增的線粒體DNA。根據(jù)起始量，這相當(dāng)于多達(dá)4000 萬(wàn)倍的線粒體DNA富集（見(jiàn)圖“ 線粒體DNA富集 ”）。擴(kuò)增后的基因組DNA的殘留量降至低，并且不會(huì)干擾線粒體特異性的下游方法，例如qPCR或直接Sanger測(cè)序。

原理

線粒體DNA使用的限制之一是需要將其與核DNA分離，特別是在需要提高線粒體DNA標(biāo)記物檢測(cè)靈敏度的情況下。分離過(guò)程涉及許多耗時(shí)的步驟，并導(dǎo)致線粒體DNA大量損失。REPLI-g線粒體DNA試劑盒通過(guò)富集總DNA樣品中的線粒體DNA序列來(lái)克服此限制。

REPLI-g線粒體DNA技術(shù)可在整個(gè)線粒體基因組中提供快速且高度一致的DNA擴(kuò)增。該方法基于多重置換擴(kuò)增（MDA）技術(shù)，該技術(shù)利用*的過(guò)程性DNA聚合酶進(jìn)行等溫基因組擴(kuò)增。與基于PCR的擴(kuò)增方法相比，REPLI-g DNA聚合酶由于具有很高的持續(xù)合成能力和鏈置換活性，因此能夠擴(kuò)增至100 kb，而不會(huì)與DNA模板分離，并且大程度地減少了序列和基因座的不等代表。

程序

使用REPLI-g線粒體DNA試劑盒擴(kuò)增線粒體DNA僅涉及兩個(gè)基本步驟（請(qǐng)參見(jiàn)流程圖“ 純化的線粒體DNA程序 ”）。首先，通過(guò)在REPLI-g mt反應(yīng)緩沖液和REPLI-g人mt引物混合物中于75°C孵育5分鐘使總的人類DNA樣品變性，然后冷卻以終止變性。但是，要使非人類物種的DNA樣品變性，應(yīng)將REPLI-g人類mt引物混合物替換為該物種的適當(dāng)引物混合物（不包括在試劑盒中）。接下來(lái)，添加REPLI-g DNA聚合酶，并且等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)在33℃下進(jìn)行8小時(shí)。

應(yīng)用領(lǐng)域

REPLI-g擴(kuò)增的線粒體DNA可用于多種下游應(yīng)用，包括：

• 基因分型（例如，SNP，缺失，插入）
• 終點(diǎn)PCR，實(shí)時(shí)定量PCR 
• 序列分析

技術(shù)指標(biāo)