BirA生物素蛋白連接酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)試劑盒

• 產(chǎn)品概述: 

  BirA生物素蛋白連接酶標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)試劑盒由AVIDITY公司生產(chǎn)，生物素連接酶(Biotin Protein Ligase)用于催化生物素化反應(yīng)，將生物素連接到特定的蛋白上。反應(yīng)原理是通過ATP三磷酸腺苷中間體(生物素5’-腺苷酸)以和靶向的方式將d-生物素共價(jià)連接到生物素受體肽/蛋白上。

  強(qiáng)烈建議使用AviTag氨基酸序列，而不是其他生物素化的肽序列。BirA酶生物素化AviTag序列是天然底物(BCCP)反應(yīng)速率的兩倍，并且比使用的其它肽序列多一個(gè)數(shù)量級或更多。與肽序列的其他生物素化相比，AviTagTM需要更少的酶量和更短的孵育時(shí)間，從而小化與蛋白酶和蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性相關(guān)的輔助問題。

來源：重組蛋白（Escherichia coli）

l 純度：

 純度＞95%，無可檢測的蛋白酶活性。

l 應(yīng)用：

生物素受體蛋白的生物素化。

l 儲存條件：

干冰運(yùn)送，解凍后分裝，避免反復(fù)凍融。

長期保存置于-80℃，短期內(nèi)使用置于-20℃，頻繁使用可短時(shí)置于4℃。在4℃條件下保存三個(gè)月?？沙?gt;90%的酶活性。

10×Biotin Ligase Buffer A、B和D-Biotin儲存于-20℃，可反復(fù)凍融,，生物素蛋白連接酶BirA，4℃存放一個(gè)月，活性保留>80。長期保存-80度，每次解凍，酶活性降低10%。

l 產(chǎn)品成分

BirA biotin-protein ligase：(3mg/ml)

10×Biotin Ligase Buffer A： 0.5 M Bicine，pH 8.3  

10×Biotin Ligase Buffer B： 100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 500 μM D-Biotin

D-Biotin：500 µM D-Biotin

反應(yīng)體系示例（250ul）（底物濃度 :≤40uM））

    (*每10 nmol AviTag’d底物需2.5μg BirA, 根據(jù)底物濃度按倍數(shù)放大本體系)

     注意：有些情況可能有必要濃縮您的底物以滿足40μM標(biāo)準(zhǔn)。

相關(guān)產(chǎn)品信息

影響因素

1  AviTag的底物肽(蛋白質(zhì))濃度與生物素化效率  

為了確保生物素化的效率，建議在終的反應(yīng)混合物中AviTag的底物盡可能接近40μM，反應(yīng)混合物中的底物濃度越低， 生物素化完成的時(shí)間越長。例如，40μM時(shí)在30-40分鐘內(nèi)*生物素化，但在4μM時(shí)，使用同樣的方法需要5個(gè)多小時(shí)。底物濃度與BirA酶活性的關(guān)系如圖A。

    2  反應(yīng)緩沖體系對BirA酶活性的影響

氯化鈉（>100 mM）、甘油（>5% W/V）、硫酸銨（>50 mM）等許多常見的緩沖液成分會(huì)抑制生物素連接酶的活性。當(dāng)?shù)孜锏鞍祝ǘ嚯模┐_有必要使用這些試劑時(shí)，應(yīng)盡量降低濃度。底物中可含有Tris(pH 8.0)， 宜濃度為10 mM，不超過50 mM。

3 底物濃度與BirA酶的數(shù)量關(guān)系

通常，對于每10 nmol底物(40μM)，我們建議2.5μg BiRA酶 生物素化條件30℃下30 - 40分鐘或室溫下約1小時(shí)?；蛘?/span>4℃過夜，ATP在4℃時(shí)水解更慢，但該反應(yīng)過程可能會(huì)因?yàn)?/span>ATP降解引起的不*生物素化，需額外補(bǔ)充ATP解決。

BufferA和BufferB已經(jīng)針對生物素化反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，底物濃度不超過40µM。如果底物濃度

達(dá)40~80µM，則要加入額外的生物素，反應(yīng)如下：1份10×BiotinLigaseBufferA，1份

10×Biotin Ligase Buffer B，7份酶底物混合物和1份D-Biotin。如果底物濃度超過80 µM，請酌情稀釋底物或與技術(shù)人員聯(lián)系獲取幫助。

4  BirA酶純度

 BirA酶經(jīng)過測試，顯示沒有可測量的蛋白酶污染。但較長的孵育時(shí)間確實(shí)會(huì)帶來目標(biāo)蛋白被蛋白酶水解的風(fēng)險(xiǎn)，因此建議使用短的*生物素化目標(biāo)蛋白的孵育時(shí)間。較長的孵育時(shí)間溶液中的ATP會(huì)隨時(shí)間水解，降低可用的生物素化反應(yīng)的ATP。因此，快速完成反應(yīng)將有利于實(shí)現(xiàn)大生物素化。

■ FAQ：

Q：如何阻止蛋白酶降解底物？

          A：本產(chǎn)品的生物素連接酶經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)量控制，沒有蛋白酶活性。如果用于生物素化的底物蛋白是未經(jīng)純化的粗提蛋白，建議加入適量的蛋白酶抑制劑，以防止在生物素化的過程中發(fā)生降解。

 Q：如何確定參與反應(yīng)的適本酶量及反應(yīng)條件？

          A：由于不同蛋白性質(zhì)差別很大、生物酶反應(yīng)存在一定的不確定性，說明書中所述反應(yīng)條件并不*適用于所有蛋白。建議用戶可以進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)：可先取少量蛋白，分成若干份相同量的底物，加入不同稀釋度的酶，相應(yīng)量的Buffer A、 B， 30℃ 1 h （或其它時(shí)間、溫度條件）反應(yīng)，以SDS-PAGE Loading Buffer終止反應(yīng)后，電泳并轉(zhuǎn)移至NC膜上進(jìn)行Western Blotting檢測（BSA封閉后直接以市售的HRP-Streptavidin孵育， DAB顯色），比較生物素化情況，選取適條件。由于Streptavidin與Biotin結(jié)合力*，因而用于Western Blotting檢測時(shí)，只需很少生物素化蛋白即可觀察結(jié)果。

 Q：如果我的底物蛋白濃度相當(dāng)?shù)颓也蝗菀诐饪s，進(jìn)行生物素化時(shí)該怎么辦？

          A:在進(jìn)行相同底物量的酶促反應(yīng)時(shí)加入更多的酶并適當(dāng)延長反應(yīng)時(shí)間。但有一個(gè)問題不容忽視，酶是蛋白質(zhì)，在酶量增加的時(shí)候，引入體系中的蛋白量亦增加了，如果后續(xù)的實(shí)驗(yàn)不容許出現(xiàn)很大量雜蛋白，那么延長反應(yīng)時(shí)間將是僅有的選擇。

Q：是否有陽性對照可以參考？

  A:有陽性對照（BIS-300陽性對照底物試劑盒）

   BIS-300試劑盒包含*生物素化的MBP-AviTag™融合蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和未生物素化的MBP-AviTag™融合蛋白，可用作BirA生物   素連接酶作用下蛋白生物素化程度的比較，用于SDS-PAGE凝膠分析或蛋白質(zhì)印跡分析。